Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）是一種基于WST-8的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的檢測試劑。WST-8【化學名：2- (2-甲氧基-4-硝J苯基)-3-(4-硝J苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，是一種類似于MTT的化合物，它在電子載體1-甲氧 基-5-甲基吩嗪鎓硫酸2甲酯（1-Methoxy PMS）存在的情況下，被線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的橙黃色甲瓚產 物（formazan）。細胞增殖越多越快，顏色越深；細胞毒性越大，則顏色越淺，對于同樣的細胞，顏色的深淺與活細胞的數量成正比，因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。
CCK-8的優點
（1)產生的甲瓚產物是水溶性的，無需換液，適合懸浮細胞
（2)不需要放射性同位素和有機溶劑，對細胞的毒性小
（3)CCK-8細胞活性檢測試劑毋需預制，即開即用
（4)靈敏度高，線性范圍寬，數據可靠，重現性好
（5)操作簡便，省時省力
（6)適合于高通量藥物篩選
CCK-8的缺點：
與MTT法相比，CCK-8的價格比較貴
CCK-8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養基顏色接近，操作過程中容易漏加或多加。
實驗一：細胞增殖分析
1）制備細胞懸液，計數。
2）在96孔板中接種細胞懸液，每孔約100μl，同樣的樣本可做3個重復。
3）將培養板放入培養箱中預培養一段時間（37℃, 5%CO2），細胞貼壁需要大約2-4h，如果是懸浮細胞，該步驟可以省去。
4）每孔各加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比較少，可能會因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕晃動培養板以幫助混勻，或者直接配置含10%CCK-8的培養基，以換液的形式加入。另外注意，加樣的過程中盡量不要產生氣泡。
5）將培養板放入培養箱中孵育1-4h。因為細胞種類不同，形成的formazan的量也不一樣，所以如果顯色不夠的話，可以延長培養時間，特別是血液細胞形成的formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6h）。
6）酶標儀測定450nm處的吸光值（OD）。
7）若暫時不測定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室溫下避光保存，這樣可以保證OD值在24h內不發生變化。
實驗二：細胞毒性分析
1）制備細胞懸液，計數。
2）在96孔板中接種細胞懸液，每孔約100μl，同樣的樣本可做3個重復。
3）將培養板放入培養箱中預培養一段時間（37℃, 5%CO2），細胞貼壁需要大約2-4h，如果是懸浮細胞，該步驟可以省去。
4）向培養板各孔中加入不同濃度的毒性物質（藥物、化學試劑等待檢測物質）。
5）將培養板放入培養箱中孵育一段時間，例如6、12、24、48h，具體時間要看待測物質的性質和細胞的敏感性。如果待檢測物質有氧化性或還原性，可在加入CCK-8之前更換新鮮培養基，以去掉待測物質的影響。如果影響比較小或者沒有影響，可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。
6）向每孔中加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比較少，可能會因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕晃動培養板以幫助混勻，或者直接配置含10%CCK-8的培養基，以換液的形式加入。另外注意，加樣的過程中盡量不要產生氣泡，以免影響OD值讀數。
7）將培養板放入培養箱中孵育1-4h。因為細胞種類不同，形成的formazan的量也不一樣，所以如果顯色不夠的話，可以延長培養時間，特別是血液細胞形成的formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6h）。
8）用酶標儀測定450nm處的吸光度（OD）。
9）若暫時不測定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室溫避光保存，這樣可以保證OD值24h內不發生變化。
活力計算：
細胞活力（%）=[A(加藥)-A(空白)]/[A(0加藥)-A(空白)] ×100
A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的OD值
A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的OD值
A（空白）：沒有細胞的孔的OD值
細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力
注意事項：
接種細胞數：針對標準96孔板，貼壁細胞的最小接種量為1000個/孔 (100μl培養基)。若為白細胞，接種量不低于2500個/孔 (100μl培養基)。如若使用24孔板或6孔板，應預先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。
CCK-8 反應時間：
懸浮細胞與貼壁細胞相比較難顯色，因此需要增加細胞數量并延長CCK-8反應時間。另外，在培養箱中孵育期間，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，造成體積不準確，從而增加誤差，因此，建議最外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。另外，如果細胞培養時間較長導致培養基顏色發生了變化，應洗滌細胞更換培養基后再加CCK8進行檢測。
空白對照：在不含細胞的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度即為空白對照。在細胞毒性實驗中，還應考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養基中加入CCK-8，測定450nm的吸光度作為空白對照。
測定波長：如果樣品為高渾濁度的細胞懸液，建議采用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。
收費標準/服務周期/提供結果：
歡迎咨詢詳談，我們會根據您的方案及需求制定詳細的服務協議。
更多實驗技術服務請瀏覽網站其他內容，或來電咨詢！
做實驗，找碩璽！您的科研生涯，我們一路相伴！
【平臺項目開展范圍】慢病毒，腺病毒，RNAi類，分子生物實驗，病理實驗，免疫學實驗，細胞實驗，動物實驗，蛋白組學實驗，芯片類實驗，并為廣大客戶朋友們提供課題設計指導、基金申請指導等服務。
【碩璽生物】已開展了數千個實驗外包項目。我們專注于醫學課題研究，已從課題申請、方案設計、試劑采購、模型構造、 標本檢測、數據分析，各個環節積累了數千個成功案例經驗，為數千個來自臨床的科研工作者解決了大量的科研問題。更多相關實驗服務信息請咨詢碩璽生物。
長按屏幕識別二維碼
打開手機掃描二維碼
