免疫熒光驗證自噬流

技術簡介

LC3是酵母自噬關鍵蛋白ATG8在哺乳動物中的同源蛋白。LC3最初被分析鑒定為microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1LC3)。LC3蛋白家族包括LC3A、B、C和GABARAP等亞家族，其中對于LC3B的研究最為廣泛。到目前為止，LC3B被認為是細胞自噬信號通路最為關鍵的標志性蛋白。LC3B是一個具有125個氨基酸殘基的蛋白，在蛋白合成后，被Atg4所酶切而失去了C端的22個氨基酸蛋白，從而暴露出C端的甘氨酸，人們把它命名為胞質形式的LC3B I。在細胞自噬的過程中，其C端暴露的甘氨酸經過一個類似泛素化的過程，以ATG7為E1樣激活酶(E1-like activating enzyme)，以ATG3為E2樣連接酶(E2-like conjugation enzyme)，以Atg12-Atg5-Atg16復合物為E3樣連接酶(E3-like ligase)，在C端甘氨酸上共價連接上磷脂酰YI醇胺(phosphatidylethanolamine, PE)而成為LC3B-PE即LC3B II。與胞質定位的LC3B I不同，LC3B II定位于自噬體(autophagosome)的內膜和外膜上。在自噬體與溶酶體融合后，自噬體外膜上的LC3B II被Atg4所酶切，而自噬體內膜上的LC3B II則被溶酶體內的蛋白酶所降解。盡管LC3B II比LC3B I的分子量要大，但由于其極強的疏水性，在SDSPAGE電泳時，LC3B II比LC3B I遷移得更快，其表觀分子量分別為14kD和16kD。自噬(Autophagy)是一種在進化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細胞內分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關，在饑餓等不利的環境條件下，細胞通過自噬降解多余或異常的細胞內組分，為細胞的生存提供能量及原材料，促進生物體的生長發育、細胞分化及對環境變化產生應答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關系。由于細胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經成為細胞生物學領域的一個新的研究熱點。

GFP-LC3B是重組慢病毒，感染后能夠在靶細胞中有效表達綠色熒光蛋白(GFP)和LC3B的融合蛋白，呈現明亮的綠色熒光，可以用于細胞自噬的檢測。

RFP-GFP-LC3B是研載生物研發的重組慢病毒，感染后能夠在靶細胞中有效表達紅色熒光蛋白(RFP)、綠色熒光蛋白(GFP) 和LC3B的融合蛋白，呈現明亮的紅色和綠色熒光，可以用于細胞自噬的檢測。自噬小體在與溶酶體融合過程中，溶酶體內的酸性環境會導致GFP熒光淬滅，這為追蹤GFP-LC3B的細胞定位增加了難度。RFP是一種紅色熒光蛋白，當其與GFP進行LC3B的共同標記時，在GFP被溶酶體酸性環境所淬滅的情況下，可以發出紅色熒光的RFP因為其卓越的穩定性而被保留。因此，通過融合表達RFP-GFP-LC3B蛋白，可以非常有效地追蹤自噬過程。在用RFP-GFP-LC3B慢病毒感染細胞后，在非自噬的情況下，熒光顯微鏡下RFP-GFP-LC3B以彌散的黃色熒光(RFP和GFP的綜合效果)形式存在于細胞質中；而在自噬的情況下，熒光顯微鏡下RFP-GFP-LC3B則聚集在自噬體膜上，以黃色斑點的形式表現出來(LC3B dot or punctae)；當自噬體與溶酶體融合后，因GFP熒光的部分淬滅而以紅色斑點的形式表現出來。

實驗流程

1. 構建含有LC3B基因的重組載體。

2. 對于測序正確的重組質粒，提取和純化高質量的不含內毒素的重組質粒。

3. 使用高效重組載體和病毒包裝質粒共轉染293T細胞，進行病毒包裝和生產，收集病毒液。

4. 濃縮、純化病毒液。

5. 用高質量的病毒液感染宿主細胞或進行穩定轉染細胞株的篩選（篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩定性）；使用藥物處理或者siRNA沉默細胞。

6. 免疫熒光標記。

7. 先在熒光顯微鏡下觀察確認標記成功，然后移至共聚焦顯微鏡下進行觀測。

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