細胞凋亡(apoptosis)一般是指機體細胞在發育過程中或在某些因素作用下,通過細胞內基因及其產物的調控而發生的一種程序性細胞死亡(programmed cell death)。細胞凋亡對胚胎發育及形態發生(morphogenesis)、組織內正常細胞群的穩定、機體的防御和免疫反應、疾病或中毒時引起的細胞損傷、老化、腫瘤的發生進展起著重要作用,并具有潛在的治療意義。
細胞凋亡途徑中各事件的發生是有時序性的,即各事件按先后順序依次發生,最終導致凋亡小體的出現,細胞隨著發生凋亡。
其典型特征如下:
早期凋亡:細胞膜結構發生改變,磷脂酰絲氨酸外翻;
早中期凋亡:細胞質密度增加,線粒體膜電位消失細胞膜,通透性改變,釋放細胞色素C到胞漿中;
中晚期凋亡:細胞凋亡信號轉導;
晚期凋亡:DNA降解為180~200bp片段大小。
凋亡早期:Annexin-V/PI雙染色法(PS在細胞外膜上的檢測)
在正常的活細胞中,磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine,PS)位于細胞膜的內側,細胞發生凋亡時,細胞膜發生變化,PS 從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面。Annexin-V(膜聯蛋白-V)是一種分子量為35-36 KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與PS高親和力結合。用熒光素(FITC、Alexa Fluor488等)標記的Annexin-V作為探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡即可鑒別凋亡細胞和活細胞。
壞死的細胞PS同樣也會從細胞膜的內表面翻轉到細胞膜的外表面,Annexin-V也能識別壞死細胞表面的PS,所以Annexin-V 無法區分壞死細胞和凋亡細胞。另外碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料,能夠與細胞內DNA結合,而且它不能透過完整的細胞膜。早期凋亡細胞和活細胞的細胞膜仍然完整,PI染料無法自由通過細胞膜進入細胞內與DNA結合,所以PI 染料無法標記凋亡細胞和活細胞,而PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜與細胞內的DNA結合,壞死細胞內的PI染料被488nm激光激發后會發射紅熒光,被相應通道接收。所以Annexin V和PI同時使用,就可以區分活細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞。
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